菌种筛选_微生物其他制药设备-迪必尔生物工程（上海）有限公司

T&J-MiniPod平行筛选发酵系统特别适合于各种微生物和基因工程菌的菌种筛选和培养的早期大批量工作，高通量筛选能力明显优于常规的摇床和生物反应器。传统的菌种初筛和复筛都是在没有任何检测参数的摇瓶或试管中进行的，筛选过程微生物的外在培养环境与工业发酵生产存在巨大反差，很多真正符合实际生产环境、性状优良的菌种往往在筛选初期就被漏筛掉了。

     T&J-minipod系列模块化迷你平行发酵系统解决了这个问题。可以通过该装置pH检测功能，根据发酵过程参数相关的原理观察到菌体生理特性的变化。带pH测量的平行筛选微型发酵罐既克服摇瓶中多参数测量的困难，又不失为代谢流分析的基本原理。微量补料技术，实现各种碳氮源的流加、pH控制或微量元素控制等。把pH实时测量与流加技术相结合，对实现以代谢流为核心的动态研究具有重要意义。用户可根据工艺需要,随意搭建模块化的高通量筛选平台，以最低的成本实现在线数据过程控制。

>菌体生长过程pH的变化规律，接种量与移种时机的研究

>基础培养基的优化

>菌体生长阶段和产素阶段最适pH的研究

>流加补料的研究，包括补料种类、速率及动力学研究

>可实现代谢流为核心的动态研究。

全容量        500ml/1L可选

径高比        1：2；装液系数60~80%

罐体材质    全硼硅玻璃，且做除静电处理

罐盖结构    全玻璃罐体、罐内无死角，带深层通气空气管和气体分布环

表面处理    内外表面镜面抛光，抛光精度<Ra0.4；所有焊缝整齐美观不打磨（按照国际标准）

pH控制系统  控制范围：2.00-12.00；控制精度：±0.02

温度控制     15℃~40℃；精度±0.2℃

通气控制     范围：0.3 ~ 420mL/hr

超微量补料控制     范围：0.2ml~200ml/min；精度：± 0.02ml

搅拌控制       50~800rpm

2.3 地衣芽孢杆菌的基因敲除

地衣芽孢杆菌基因敲除的方法在我们过去的论文中有描述（Cai et al., 2016）。在这里，以构建cydB缺陷菌株为例。简言之，以地衣芽孢杆菌WX‐02基因组DNA为模板，采用引物cydB‐KF1/R1和cydB‐KF2/R2扩增得到cydB基因的上游和下游同源臂，经重叠扩展(SOE)‐PCR得到融合片段。融合片段入到限制酶位点XbaI/SacI酶切后的T2(2)‐Ori中。菌落PCR和DNA测序证实重组质粒(T2‐cydB)构建成功。

   将重组质粒T2‐cydB电转化至WX‐02，通过菌落PCR和质粒抽提证实转化成功。阳性转化子首先在含20mg/L卡那霉素的LB培养基中， 45℃条件下培养促进单交换发生，然后在无卡那霉素培养基中37℃培养。卡那霉素敏感菌落经菌落PCR验证，获得双交换转化株。这个突变株经DNA测序后证实，并命名为WXΔcydB。其他的基因（ythA, ctaC, qoxA, cydC, narG, nasC, resD）的敲除采用相同的方法。

2.4 基因表达载体的构建

   基因表达载体的额构建参照之前发表的方法(Cai et al., 2016), 我们以narG过表达载体的构建举例。简言之，采用引物分别扩增枯草芽孢杆菌P43启动子，编码呼吸型硝酸还原酶基因narG，淀粉酶终止子序列amyL，并用SOE-PCR将三个片段融合到一起。融合的片段插入至限制性内切酶EcoRI/XbaI切后的PHY300PLK。菌落PCR和DNA序列证实重组质粒(pHY-narG) 构建成功。采用相同的方法构建了其他基因（vgB, purB, adK, nasC, and resD)）的表达载体。

2.5 地衣芽孢杆菌中基因整合

为了构建同时过表达vgb, adK, 和 resD基因的菌株，按照之前发表的方法将P43启动子介导的单个基因整合到地衣芽孢杆菌的染色体中(Cai, Wang, et al., 2017). 通过菌落PCR和DNA测序对重组菌株进行验证

2.6 测定细胞生物量，γ-PGA产量和葡萄糖

细胞生物量通过细胞干重来测量。γ-PGA浓度通过高效液相色谱参照之前描述的方法完成(Wang, Yuan, Wei, Chen, & Chen, 2015). 葡萄糖浓度通过SBA-40C生物分析仪测定（中科院，山东）。

2.7 ATP含量测定

ATP含量通过之前发表的方法测量(Li et al., 2014)。简言之，1ml 发酵液加4ml水，4℃12000g离心10分钟，沉积细胞加入200 μL裂解缓冲液再次混悬置于4℃。ATP浓度测定基于ATP检测试剂盒使用手册（碧云天，中国），换算成单位细胞干重的ATP含量

2.8 分析方法

硝酸盐是由水杨酸法测定的。亚硝酸盐有先前Nicholas和Nason的重氮偶联法测定 (Cataldo, Maroon, Schrader, & Youngs, 1975; Nicholas & Nason, 1957)。采用气相色谱测定乙二醇和丁二醇的含量(Qiu et al.,2016)。维持系数是根据以前发表的方法确定的(Liu et al., 2014). 采用Pirt模型对维持系数进行测量如下：

qglc = μ/Ymax + mglc.

其中qglc为比葡萄糖消耗速率(mmol/g DCW/h), μ是比生长速率，Ymax是最大产量（(g DCW/mmol), mglc.是维持系数(mmol/gDCW/h).

2.9 基因转录水平的测定

重组菌株的基因转录水平按照之前发表的方法分析(Cai, He, et al., 2017).细菌总RNA由TRIzol®试剂提取，微量DNA由脱氧核糖核酸酶I消化，互补DNA（cDNA）的第一条链由cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)扩增。地衣芽孢杆菌WX-02的16S rRNA作为内参基因。重组菌株的基因转录水平通过对内参基因16S RRNA归一化处理后得到。所有实验三组平行对照。

2.10 在（MiniBox)1L生物反应器中生产γ-PGA

 菌株WX-02和WX-BCR的γ-PGA分批发酵实验在1L发酵罐（迪必尔生物工程上海有限公司）中完成，采用0.6LBFCNA培养基。初始pH和接种量分别为7.2和3%，搅拌速度为400rpm。尾气中的O2和CO2的含量由尾气分析仪测量，氧传递速率（OTR），二氧化碳释放率（CER），呼吸熵（RQ）和溶氧传递系数（KLa）由尾气分析装置计算得到（迪必尔生物工程上海有限公司）。

3.1 单个呼吸链基因的缺失对γ-PGA产生，ATP含量和细胞生物量的影响

   地衣芽孢杆菌中有四条呼吸链，包含（a）细胞色素caa3氧化酶，（b）细胞色素aa3氧化酶，（c）细胞色素bd氧化酶 和（d）YthAB 氧化酶，其分别由ctaCDEF, qoxABCD, cydABCD, 和 ythABC编码(Winstedt, Yoshida,Fujita, & von Wachenfeldt, 1998)。本实验中，这四条途径通过敲除相应的基因被单独阻断，产生的菌株分别命名为WXΔcatC, WXΔqoxA, WXΔcydB,和WXΔythA

   将上述四个突变菌株和对照菌株WX-02在BFCNA培养基中进行培养。通过测定γ-PGA产量，ATP含量和细胞生物量来评估每条呼吸链阻断对γ-PGA合成的影响。如图2a所示，菌种筛选,高通量其他制药设备，与对照菌株相比，菌种筛选,其他制药设备摇床，cydB缺陷菌株WXΔcydB 的γ-PGA产量提高了15.42%， 而突变株WXΔqoxA 和WXΔythA的γ-PGA产量则分别降低了14.17%和21.05%。与原始菌株WX-02相比，WXΔcydB的ATP含量（2.61 μmol/g DCW）增加了17.38%，而缺失qoxA和ythA会减少ATP含量（图2b）。另外，与WX-02相比，cydB和cydC缺陷菌株的最大细胞生物量分别增长了8.88%和5.51%，每克细胞的γ-PGA产量分别提高了5.64%和6.18%。qoxA和ythA的缺失降低了细胞生长，不利于γ-PGA的合成（图2c）。研究结果还表明，与WX-02相比，cydB缺陷菌的维持系数降低了17.89%(0.37mmol/g DCW/h)， ythA和qoxA的缺失则提高了维持系数。ctaC的缺失对γ-PGA产量，细胞生长，ATP含量和维持系数没有显著影响（图2）。此外，细胞色素bd泛素氧化酶ATP结合蛋白基因cydC的缺失也会降低细胞代谢系数，促进ATP供给和γ-PGA产量的增加。

另外，构建了cydB和cydC双突变株，命名为WX-BC，从而进一步阻断细胞色素bd氧化酶分支途径。WX-BC在所有突变株中表现最为突出，其最大γ-PGA的产量为37.60g/L，比WX-02高了19.27%。与对照菌WX-02相比，WX-BC的最大ATP含量和细胞生物量分别提高了22.08%和13.21%。WX-BC的最大γ-PGA产率为5.92g/g DCW，比WX-02的5.53g/g DCW高了7.05%，菌种筛选,水处理菌种相关，迪必尔生物工程（上海）有限公司,迪必尔生物工程,同时WX-BC的维持系数（0.34mmol/g DCW/h）与WX-02（0.45mmol/葡萄糖， 图2d）相比降低了24.45%。总之，结果证实，地衣芽胞杆菌细胞色素bd氧化酶分支途径具有较高的维持代谢能，阻断这一分支是有利于ATP供应和γ-PGA生产。