长春双荧光素酶报告基因实验-西宁染色质免疫共沉淀公司-西安淳风生物科技有限公司 郝东云介绍，从技术链条来看，转基因玉米新品种的培育划分为上游功能基因研究、中游的新材料创制和评价，下游的新品种选育及产业化三大部分。郝东云同时介绍，整个研发到获得认证的过程或需要10年。转基因玉米研发首先要做的是表达载体构建。即将需要进行转基因操作的目的基因，通过分子生物学的手段进行分离，然后构建到表达载体上，将构建好的表达载体转化到农杆菌菌株中，低温保存待用。这个步骤需要在封闭的实验室完成。其次还需要的步骤包括遗传转化、植株再生等，最后放在花盆培育的植株将会慢慢开花结实。但长大结实的植株并不意味着转基因玉米研发获得成功。“我们要从上千上万个植株中选出最满意的性状，然后转育到合适的品种里，转化率一般低于10%。”郝东云解释。
回答：泛素化修饰自20世纪70-80年代发现以来，已经被证实是介导真核细胞内蛋白质降解的最主要的途径，它在调控蛋白质稳定性、活性及亚细胞定位等方面具有非常重要的作用，从低等到高等生物，这一修饰体系均广泛存在、很多酶类保守存在，在进化中具有重要的生物学功能，现在已经了解到细胞内的诸多生命活动过程都离不开泛素化修饰的精细调控，比如细胞周期调控、细胞凋亡、细胞信号转导等等，在机体各组织器官的稳态调节中，泛素化修饰都发挥着不可替代的功能。2004年诺贝尔化学奖授予了泛素化降解的三位发现者，就是学术界对这一修饰类型重要性的最好的认可。泛素化修饰降解的异常与包括肿瘤、神经退行性疾病、自身免疫病、骨质疏松症等人类疾病的发生发展密切相关。
双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）目前由两个主要的应用方向，第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。
实验原理：
1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）
2） 将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
实验步骤：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2） 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。
（3） 筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。
（5） 培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于6孔板中，生长24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7） 用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）目前由两个主要的应用方向，第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。
实验原理：
1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）
2） 将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
实验步骤：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2） 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。
（3） 筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。
（5） 培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于6孔板中，生长24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7） 用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）目前由两个主要的应用方向，第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。
实验原理：
1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）
2） 将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。
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实验步骤：
（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2） 设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。
（3） 筛选阳性克隆，测序，扩增克隆并提纯质粒备用。
（4） 扩增转录因子质粒（或microRNA质粒），提纯备用，同时准备相应的空载质粒对照。
（5） 培养293细胞（或其它目的细胞），并接种于6孔板中，生长24小时（80%汇合度）。
（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7） 用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8） 加入酶作用底物，于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。
（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较，判断影响因子是否有效的作用于靶基因。
近日，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所杨青川研究员及其科研团队在国际上首次发现了紫花苜蓿开花调控基因——CCCH类型锌指蛋白MsZFN基因。这将为紫花苜蓿开花控制调控机制研究，加快紫花苜蓿早熟、耐盐新品系选育奠定基础。相关研究结果已发表于《植物科学（Plant Science）》上。 据杨青川介绍，锌指蛋白是广泛分布于生物体内的一类转录因子，在生物体内起到转录调控的作用，现已经有大量的锌指蛋白被分离和鉴定出来，但CCCH类型锌指蛋白作为其中的一类，功能研究相对较少，目前为止，尚未有MsZFN及其同源基因功能的相关报导。 杨青川团队在研究紫花苜蓿MsZFN基因耐盐调控机制的同时，发现该基因在叶中表达量最高，花中表达量最低，在黑暗条件下，表达量上升。通过双分子荧光互补实验证实，MsZFN蛋白能够在植物细胞内形成二聚体或多聚体。通过农杆菌介导的方法获得转基因植物，发现该基因过量表达能够明显推迟转基因植物的开花时间。（通讯员 邬震坤） .西安淳风生物科技有限公司___长春双荧光素酶报告基因实验-西宁染色质免疫共沉淀公司-西安淳风生物科技有限公司
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