Co-IP

一、实验原理：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于研究两个蛋白质在活体细胞内生理性相互作用的经典的方法。当活体细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，与X在细胞内结合的蛋白质Y可以与蛋白质X一起以复合物的形式被沉淀下来，然后经Westernblot或质谱的方法对蛋白质Y进行检测或鉴定。二、实验目的：确定两种目标蛋白质是否在活体细胞体内相互作用，也可用于确定一种特定蛋白质的新的相互作用搭档。三、操作步骤：1.适用范围依据抗体类型（蛋白质X自身特异性抗体、蛋白质X融合商品化标签抗体）。本方法试例举：蛋白质X融合FLAG标签，将该载体转基因转入水稻获得稳定转基因植株，然后用FLAG标签抗体利用Co-IP方法沉淀与蛋白质X互作的蛋白质复合物，用Westernblot方法检测蛋白质Y是否一起被沉淀下来，以确定在水稻体内蛋白质X和蛋白质Y是否真正相互作用。2.取水稻叶片5g，经液氮研磨后，加入3倍体积蛋白IP缓冲液，在4°C混匀30min。3.于4°C，12,000g离心30min，将上清转移至一个预冷的新的离心管中。4.用0.22µm滤膜过滤上清，取过滤的50µl上清作为Input，用于蛋白质X的检测。5.Anti-FLAGM2AffinityGel预处理。取出50µl预混匀的Anti-FLAGM2AffinityGel转移至一预冷的离心管中。于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。加入20倍体积预冷的TBS缓冲液以平衡Gel，于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；重复3次。于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之。6.取蛋白质加入到已平衡化的Anti-FLAGM2AffinityGel中，于4°C孵育。7.洗脱Gel。于4°C，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之。加入1,500µl预冷的IP缓冲液洗脱Gel，于4°C孵育5min，4,000rpm离心1min，小心将上清吸取弃之；如此重复3次。于4°C，12,000rpm离心15s，小心将上清吸取弃之。8.加入约40µl2倍上样缓冲液，100°C变性5min，稍离心，取适量体积进行Westernblot实验，分别用商品化FLAG标签抗体和蛋白质Y抗体进行检测。

查看Co-IP全部详情 >>