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如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10μL0!1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下.在24小时内吸光度不会发生变化。注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响.当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可!

CCK法与其它检测方法之间的比较:MTT法:形成的formazan的水溶性差,产品性状为粉末,使用方法为配成溶液后使用,检测灵敏度高,检测时间较长,检测波长为560-600nm,细胞毒性高,细胞形态完全消失,试剂稳定性一般,可以大批量样品检测,便捷程度一般.XTT法:形成的formazan的水溶性好,产品性状为2瓶溶液,使用方法为现配现用,检测灵敏度很高,检测时间较短,检测波长为420-480nm,细胞毒性很低,细胞形态不变,试剂稳定性较差,非常合适大批量样品检测,便捷程度便捷!


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)Ⅱ、细胞活性检测在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)!将培养板放在培养箱中预培养(在37℃,5%CO2的条件下)!向每孔加入10μL的CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数).将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度.如果暂时不测定OD值,打算以后测定的话,可以向每孔中加入10μL0!1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下!

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CCK用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定等!注意事项:①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。②有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔减的差异!加入CCK试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基页面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数!③白细胞可能需要培养较长时间!④当使用标准96孔板时,贴壁细胞的至小接种量至少为1,000个/孔(100μL培养基)。


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操作说明Ⅰ、制作标准曲线(测定细胞具体数量时)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞!按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔.接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线.根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间!

检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100μL培养基)!如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液!⑤如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490nm之间的滤光片,但是450nm滤光片的检测灵敏度至高!⑥培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响.


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