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江南大学生物系统与生物加工过程研究室提供在线搅拌釜反应器放大计算、反应器在线放大计算、CFD流场模拟。

数字孪生、数字双胞胎

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"多联小型平行发酵系统基础上，构建一个人工神经网络1和2，1的输入端为反应器全部的操作参数，如搅拌、气速、补料流量、发酵时间等，输出端为表征发酵效果的参数，如产量、浓度、转化率、发酵强度、能耗，等。发酵过程中，1实时对发酵过程进行学习，预测发酵效果。2使用1的一个实时副本，通过调整其输入值得到一个最优的操作条件组合，并反馈给反应器的控制系统。操作条件改变后的发酵数据再次进入1，如此循环往复，实现发酵工艺的自动优化。

  使用上述神经网络的一个实时副本（即虚拟发酵系统，或称数字孪生）和一套优化算法，计算最优操作条件并实时反馈给PLC进行测试。测试结果再次返回首个神经网络进行迭代优化。

以上两步由软件控制、24小时不间断连续反复进行（即机器学习的过程）。

不同培养基成分对发酵有着错综复杂的交互影响。这种影响很难用直白的机理模型来模拟，因为变化太多

2、神经网络就是不考虑机理，但是做大量的实验，然后拟合出一个模型来，能表征这些相互影响

3、如果用神经网络拟合了有限的实验数据之后，就可以任意调整培养基成分，然后从中找到最优的组合"

1 毕赤酵母表达系统

1.1毕赤酵母表达系统概述

毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速的一个真核表达系统，对于异源表达有许多优点：①其分子遗传操作简单；②AOX I启动子具有很强的诱导启动特性，适合多种外源基因的高效表达；③重组毕赤酵母从摇瓶水平发酵扩大到细胞高密度发酵非常容易，外源基因的表达水平因此得到很大的提高，利于工业化生产；④外源蛋白的积累不会毒害酵母细胞；⑤毕赤酵母自身分泌蛋白少，简便纯化工艺；⑥外源基因重组在染色体实现一起复制和同步遗传，外源基因不易丢失。

基于以上，毕赤酵母得以在高密度发酵发挥其巨大潜力。

1.2 常用表达菌株及表达载体

1.2.1表达菌株

目前，用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建，主要有：Y-11430、M-G100-3、GS115、KM71和SMD1168。其中Y-11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型。GS115有完整的AOX Ⅰ基因，在甲醇培养基上表型为Mut+，当用重组表达载体转化后，因为表达载体线化所用酶不同，其转化子表型可能是Mut+或者Muts，可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定；KM71的AOX Ⅰ基因被ARG4替代，虽然AOX Ⅰ和AOX Ⅱ有97%同源性，但AOX Ⅱ利用甲醇的能力远比AOX Ⅰ弱，在甲醇培养基上表现为Muts，其转化子也是Muts，表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，特别适用于分泌表达载体，可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解。

1.2.2 表达载体

P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体。P.pastoris既有分泌表达型的，又有胞内表达型的，常用的表达载体主要：pPIC9、pPIC9K、pHILS、pAO815、pHIL-D2和pPICz等，其中pPIC9K和pHIL-S为分泌型表达载体，而pAO815、pHIL-D2和pPICz为胞内型表达载体。多数P .pastoris表达载体还含有HIS4基因，它可以作为转化体的选择标记，同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记，如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等；还有一些载体含有来自于AOX Ⅰ基因的3’端侧翼序列，可以用来指导含外源基因的组件插入3’AOX Ⅰ基因位点或者以基因整合的方式整合到酵母染色体的AOX Ⅰ位点。一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。多拷贝发生在AOX Ⅰ或者组氨酸基因位点，但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%-10%，在线生物反应器放大,其他制药设备模拟计算，为此，人们根据不同表达载体的组成特点，如pPIC3K和pPIC9K含有kanr抗性基因；pPICz系列含有bler基因，利用基因剂量效应，分别依靠G418R或者ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815，一般通过多拷贝表达盒BamHI-BglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体，然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子。

影响外源蛋白表达的因素

（1）启动子

在转录水平调控基因的表达常用的启动子主要有PAOX I、PAOX II和PDAS，找在线生物反应器放大, 生物反应器放大相关，其中PAOX I对外源蛋白的驱动强度最高。最近在毕赤酵母中克隆到一个组成型启动子PGAG，由于组成型启动子不需要使用甲醇来诱导异源蛋白质的表达，简化了发酵工艺，并且对于某些产物表达量更高，因此成为最有潜力替代PAOX I的启动子。

（2）外源基因的理化特点

外源蛋白的表达和分泌同时也受其自身的理化特点所影响。蛋白质自身特点决定了蛋白质被加工修饰后的去向，很难使不分泌的蛋白实现分泌。因此外源蛋白的结构和组成都会影响毕赤酵母对外源蛋白的分泌以及细胞外蛋白酶的水解性质。可见，外源基因自身特点很大程度上决定了分泌型外源蛋白在毕赤酵母中产量的高低。

（3）外源基因拷贝数

在毕赤酵母中外源基因的拷贝数也可以影响其表达水平。有研究指出高拷贝外源基因可以提高外源蛋白表达水平。但也有些研究者发现并不是任何外源蛋白都是表达水平随着外源基因的拷贝数增加而提高，原因是高水平表达有可能会限制阻断分泌途径。为了提高外源基因的表达水平可以尝试提高整合基因的拷贝数，而且目前提高外源基因拷贝数的方法发展得也越来越成熟。例如Invitrogen公司发展的pPIC9K质粒上带有G418的抗性基因，可以快速筛选高拷贝转化子。

（4）蛋白质分泌

外源蛋白表达最关键的影响因素是基因序列。信号肽影响着蛋白的分泌表达水平，如果宿主菌株自身信号肽序列很难达到预期的效果，迪必尔生物工程（上海）有限公司,迪必尔生物工程,可以借助酿酒酵母α-交配因子的信号肽序列，如用于提高胰岛素等小分子肽的表达量。

（5）重组转化子的筛选

在对转化子进行大量筛选过程中常常发现，即使产生了有高效表达外源蛋白的潜力菌株，却不能筛选出来。因此为了达到高水平表达外源蛋白的目的，找到便捷、有效地筛选优良重组菌株的方法尤为重要。摇瓶水平发酵实验是常用的转化子的筛选方法。由于摇瓶发酵中溶氧条件的限制，培养基的pH值无法得到很好的控制及不能调整碳源的流加速率等，外源蛋白的表达水平通常不能反映发酵罐水平发酵的情况。但是对每一个表达菌株都进行发酵罐实验，会带来巨大的工作量。现在发展了一种shaken ceramic membrane flask（SCM）摇瓶培养技术，这种摇瓶培养相对于普通的摇瓶培养更好地反映发酵的发酵罐外源蛋白的水平，比正常发酵提高2-8倍。

发酵条件的影响

研究发现用发酵罐发酵，表达产物的产量比普通摇瓶发酵最大可提高100倍，可见发酵条件对外源蛋白表达水平影响极大，如培养基的组分，诱导时温度，诱导时pH，补料策略等。影响因素将在后面详述。

1.4 毕赤酵母高密度发酵技术

1.4.1 毕赤酵母高密度发酵的一般工艺过程

控制生物反应器在合适的条件下，毕赤酵母细胞生长迅速并且能够达到较高的细胞密度（细胞湿重>400g/L）。参照 Invitrogen公司的毕赤酵母发酵指导手册，现在毕赤酵母较普遍采用的发酵过程一般分为三个阶段，即批次发酵阶段（Glycerol batch phase），流加阶段（Glycerol fed-batch phase）和甲醇流加诱导阶段（Methanol fed-batch phase）。

在批次发酵阶段，通常在培养约16-24h后毕赤酵母耗尽发酵基础培养基中所含4%的，通过对通气和搅拌转速的调节维持溶氧水平在30%以上，菌体湿重增加。

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在流加阶段，批次发酵后期，菌体在将其耗尽时溶氧值会骤升至100%左右，这时开始补充流加50%（w/v）的，控制流加速率，维持溶氧水平在30%左右，在此阶段细胞群的产生决定了外源蛋白的表达。适当调节补料时间的长短，可以提高蛋白质的产量。流加完成时细胞湿重期望能达到150-300g/L。由于水平过高会有毒害作用，所以的最高水平控制在4%。

在甲醇流加诱导阶段，停止流加，查在线生物反应器放大, 生物反应器放大理论相关，待培养基中的完全消耗殆尽后，以溶氧曲线出现峰值即溶氧水平骤升至100%为信号，开始甲醇的流加诱导AOX 启动子表达驱动外源基因表达。此阶段中，每小时增加一次甲醇补加速率，持续调节5~8h至溶氧稳定在20%左右，使菌体慢慢适应利用甲醇进行生长并表达目标外源蛋白。根据所表达的蛋白和菌株的不同，此阶段控制最终甲醇流加的速率和流加持续时间都会有所不同。

1.4.2影响毕赤酵母高密度发酵的因素

1.4.2.1 培养基

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培养基是细胞进行高密度发酵的一个基本发酵条件，其组成对细胞的生长和外源基因诱导表达的影响最为直接。现在的培养基一般采用Invitrogen公司建议的如BMGY/BMMY和BSM，其中BMGY/BMMY 和培养基中含有磷酸盐缓冲液，可以维持在一定pH范围内，适合pH敏感度较高的外源蛋白的分泌表达。无机盐培养基BSM较便宜，一般配合使用PTM1微量元素溶液用于发酵罐水平的发酵。利用BSM进行发酵，有的外源蛋白能高效表达，有的则表达量少，甚至有的外源蛋白在 BSM 培养下根本不表达。所以可以通过优化BSM来提高目的蛋白产量。由于PTM1微量元素溶液成分较为复杂，必须过滤除菌，在发酵液中易生成沉淀，对大规模发酵造成很大影响，有研究人员发现可以用酵母提取物或者麦芽汁来替代PTM1，即简化工艺又降低成本，适用于工业化生产。

1.4.2.2 诱导期培养 pH

培养基的初始pH值对发酵过程中菌体生长水平、污染杂菌及表达蛋白的降解都有很大影响。不同的重组工程菌，有不同的最适生长和诱导pH值。P.pastoris在pH为3.0~7.0下均可正常生长，但当p H低于2.0时菌体便不能正常生长，甚至会阻碍生长，最适菌体生长的pH范围为4.8~5.5。发酵过程中需要根据目标蛋白进行相应调整，在甲醇诱导阶段采用的p H需要能保持目标蛋白活性。

发酵培养基的pH对P.pastoris的细胞繁殖和外源蛋白合成的影响主要表现在下面几个问题上：当p H值不适合以至抑制细胞中某些酶在代谢过程中的活性时，对正常的细胞代谢通路造成阻碍；影响P.pastoris细胞膜的通透性，阻碍细胞吸收培养基的必需营养物进行生长和排出代谢物到细胞外部；影响P.pastoris细胞利用中间代谢产物；菌体的代谢过程往往会因pH值不同而发生改变，使目标蛋白的产量发生改变。

因此，虽然P.pastoris的生长pH范围较宽，但也必须根据表达的外源蛋白不同选择尽量合适的pH值，尤其是在诱导外源蛋白表达阶段。