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样本要求及推荐使用的试剂盒

1.体外培养的细胞：离心处理采集的细胞悬液，吸弃上清液，立即提取DNA或在–20℃或–80℃下保存细胞。首选使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP304）或Qiagen试剂盒。

2.新鲜组织样品：新鲜采集的组织可以立即冰冻，并在–80℃下，或者液氮中储存。首选使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP304），或Qiagen试剂盒。

3.血液DNA提取：采用肝素或EDTA处理的血液样本可在2–8℃下储存数天，或在–20℃或–80℃下储存数周。此外，采用ACD溶液B（0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖；每6ml血液使用1ml）处理的血液样本，在2–8℃下至少可储存5天，在–20℃下至少可储存1个月。如需长期储存，可准备血液细胞核，并在–20℃下储存。首选使用商业化提取试剂盒，如天根血液标本提取试剂盒（货号DP304）。

4.血浆或血清游离DNA：样本可在2–8°C下储存数小时。如需长期储存，建议在–20℃或–80℃下冰冻。首选使用商业化提取试剂盒，如天根血清/血浆游离DNA提取试剂盒（货号DP339）或Qiagen公司试剂盒。

5.干血斑基因组提取：建议使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP334）

6.石蜡包埋及病理组织切片：拿到样品后要尽快在4-10%的福尔马林中固定，固定时间以8-24小时为宜，时间过长导致基因组断裂，影响下游实验。选取保存时间不超过两年的样本，首选使用商业化提取试剂。如天根石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒（货号DP330）或QiagenFFPEDNAkit（货号56404）。

7.质粒DNA：首选使用商业化提取试剂盒，一般小提试剂盒建议使用天根碱裂变质粒小提试剂盒（货号DP105），细胞转染用途等等要求较高的质粒提取建议使用Qiagen无内毒素质粒提取试剂盒。

5.干血斑DNA提取

6.石蜡组织样品DNA的提取

7.质粒DNA提取

①溶液P1在使用前先加入RNaseA和TIANRed（将试剂盒中提供的RNaseA和TIANRed全部加入），混匀，置于2-8℃保存；使用前请先在漂洗液PWT中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

②取1-4ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(~13,400×g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

③向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA和TIANRed），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。彻底颠倒混匀，混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀，由于菌体的存在，混匀后的溶液为浑浊的红色。

④向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。由于使用了TIANRed，添加溶液P2彻底混匀后，溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫色中混杂有浑浊的红色，则说明裂解不充分，继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。

⑤向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心2min。注意：加入溶液P5后应立即混合，应快速上下颠倒混匀，避免产生局部沉淀。上清中含有少量微小白色沉淀对后续实验没有任何影响。如果上清中存在大量微小白色沉淀，可再次离心后取上清。由于使用了TIANRed，添加溶液P5彻底混匀后，溶液为澄清的黄色，如果在黄色中混有紫色，则说明复性不充分，继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。

⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑦向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，快速提取dna,进口其他生物制品厂家，将吸附柱CP3放入收集管中。

⑧将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

⑨将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液TB或ddH2O，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒将质粒溶液收集到离心管中。

⑮测DNA浓度及OD260与280比值，保存样品于-20℃。

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样本DNA提取

1.体外培养细胞DNA的提取

2.新鲜组织样品DNA提取

①取新鲜或冻存的组织10-30mg（脾组织应少于10mg），加入500-1000ul冰的PBS，使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎（尽量越碎越好，形成细胞悬液），10000rpm离心1min，弃上清。

②加入200ul缓冲液GA，震荡混匀，加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。

③56℃孵育裂解1-3h，期间可适当摇晃颠倒样品，使样品混匀裂解充分，直到组织块完全消失。

④加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃消化10min，溶液应变清亮，短暂离心去除管壁水珠。

⑤加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15s。

⑥将上一步所得的溶液和沉淀都转入到一个含2ml收集管的吸附柱CB3中，12000rpm（13400g）离心30s，长沙科文生物科技有限公司,科文生物科技,弃流出液。

⑦向吸附柱中加入500ul缓冲液GD（使用前请确认是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃流出液。

⑧向吸附柱中加入600ul漂洗液PW（使用前请确认是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃流出液。

⑨重复上一步一次。

⑩12000rpm离心3min，以去除收集柱中残余液体。

⑪将吸附柱放入一个洁净的1.5ml离心管，吸附柱开盖后放置5min，以去除残余乙醇。

⑫加入ddH2O50ml，室温静置5min。

⑬14000rpm离心1min，找快速提取dna,基因组dna提取相关，收集洗脱液。

⑭测DNA浓度及OD260与280比值，保存样品于-20℃。

3.血液DNA的提取

①取200ul全血置于1.5ml离心管中，不足200ul，加入缓冲液GA补足，如需处理更大体积的血液，如300-1000ul，按以下步骤操作：在样品中加入3倍体积的红细胞裂解液（货号RT122），颠倒混匀，室温放置5-10min，期间可再颠倒混匀几次，10000rpm离心1min或3000rpm离心5min，弃上清留白细胞沉淀，加入200ul缓冲液重悬细胞。

②加入20ul的蛋白酶K，混匀。

③加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃消化10min，溶液应变清亮，短暂离心去除管壁水珠。

④加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15s。

⑤将上一步所得的溶液和沉淀都转入到一个含2ml收集管的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃流出液。

⑥向吸附柱中加入500ul缓冲液GD（使用前请确认是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃流出液。

⑦向吸附柱中加入600ul漂洗液PW（使用前请确认是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃流出液。

⑧重复上一步一次。

⑨12000rpm离心3min，以去除收集柱中残余液体。

⑩将吸附柱放入一个洁净的1.5ml离心管，吸附柱开盖后放置5min，以去除残余乙醇。

⑪加入ddH2O50ml，室温静置5min。

⑫12000rpm离心1min，收集洗脱液。

⑬测DNA浓度及OD260与280比值，保存样品于-20℃。

4.血浆或血清DNA的提取

①取100-200µl血清/血浆到2ml的离心管中，如不足100µl，加缓冲液GA到100µl终体积。

②加入20ul蛋白酶K溶液，涡旋混匀。

③加入200µl的缓冲液GB（可加入1µlCarrierRNA储存液，浓度为1µg/µl，CarrierRNA储存液的配制见第2页），正宗快速提取dna,dna提取实验相关，轻轻颠倒混匀。

④56℃孵育10min，并不时摇动样品。简短离心

⑤加入200µl的乙醇（96-100%）。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

⑥将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

⑦向吸附柱CR2中加入500µl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

⑧向吸附柱CR2中加入600µl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）12,000rpm(~13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

⑨重复操作步骤8。

⑩12,000rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑪将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50µlddH2O，室温放置2-5min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

⑫为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再次加入吸附柱CR2中，室温放置2min，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，收集洗脱液。

⑬测DNA浓度及OD260与280比值，保存样品于-20℃。

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