科文生物主要使用基于RiceIntron产生shRNA发夹结构的pTCK303系列载体为客户构建植物干扰载体，该系列载体也具有花椰菜花叶病毒35S启动子（promoterofCauliflowermosaicvirus35S，CaMV35S），载体上携带卡纳抗性基因（Kan+）和潮霉素（Hygromycin）筛选标记，同时还拥有GUS基因。研究者可以针对目的基因序列，设计和构建互补的基因片段，在体内形成shRNA结构，从而抑制目的基因的表达。pTCK303质粒图谱见图1。服务简介通过基因合成或直接从植物基因组中调取获得目的基因片段，然后亚克隆至带有启动子、复制子、抗性基因及筛选标记的植物表达载体上，以实现目的基因的过表达，从而对目的基因的生物学功能进行研究。

服务简介基因合成是指在体外通过化学方法人工合成双链DNA分子，并克隆至目的载体。基因合成的序列最长可达12KB，错误率低，且在合成过程中可以对目的基因的密码子进行优化，目前已广泛应用于基因研究中。服务内容根据客户提供的基因序列，合成目的基因，并将其克隆至客户指定的载体上。服务特点1.合成周期短、速度快，保证合成获得的基因片段序列和客户所需的目的序列完全一致。2.科文生物可以为客户合成任何基因，包括富含特殊结构如重复序列（重复次数无限制）、高GC含量、发夹结构、连续单一碱基重复等的复杂基因片段。

服务简介利用质粒或慢病毒，将外源的DNA运送至目的细胞中，并通过抗生素筛选，使外源DNA片段整合至宿主细胞的基因组中，使宿主细胞能够长期稳定的表达目的基因（或shRNA、MicroRNA、LncRNA、CircRNA等），此过程即为稳定细胞株筛选。服务内容根据客户要求，筛选客户所需的稳定细胞株并进行鉴定（观察荧光、Real-timeqPCR检测或Western-blot检测）。服务特点1.科文生物拥有经验丰富的细胞生物学技术团队，熟悉各种细胞的转染效率，可以根据客户的要求设计合适的稳定细胞株筛选方案，成功率高，实验周期短。

细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法。原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

样本要求及推荐使用的试剂盒1.体外培养的细胞：离心处理采集的细胞悬液，吸弃上清液，立即提取DNA或在–20℃或–80℃下保存细胞。首选使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP304）或Qiagen试剂盒。2.新鲜组织样品：新鲜采集的组织可以立即冰冻，并在–80℃下，或者液氮中储存。首选使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP304），或Qiagen试剂盒。3.血液DNA提取：采用肝素或EDTA处理的血液样本可在2–8℃下储存数天，或在–20℃或–80℃下储存数周。此外，采用ACD溶液B（0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖；每6ml血液使用1ml）处理的血液样本，在2–8℃下至少可储存5天，在–20℃下至少可储存1个月。如需长期储存，可准备血液细胞核，并在–20℃下储存。首选使用商业化提取试剂盒，如天根血液标本提取试剂盒（货号DP304）。4.血浆或血清游离DNA：样本可在2–8°C下储存数小时。如需长期储存，建议在–20℃或–80℃下冰冻。首选使用商业化提取试剂盒，如天根血清/血浆游离DNA提取试剂盒（货号DP339）或Qiagen公司试剂盒。5.干血斑基因组提取：建议使用商业化提取试剂盒，如天根新鲜标本提取试剂盒（货号DP334）6.石蜡包埋及病理组织切片：拿到样品后要尽快在4-10%的福尔马林中固定，固定时间以8-24小时为宜，时间过长导致基因组断裂，影响下游实验。选取保存时间不超过两年的样本，首选使用商业化提取试剂。如天根石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒（货号DP330）或QiagenFFPEDNAkit（货号56404）。7.质粒DNA：首选使用商业化提取试剂盒，一般小提试剂盒建议使用天根碱裂变质粒小提试剂盒（货号DP105），细胞转染用途等等要求较高的质粒提取建议使用Qiagen无内毒素质粒提取试剂盒。

众所周知，对于质粒提取产品，内毒素水平低，能确保提取出来的产物在下游实验进展中得到很好的应用，因为内毒素会降低内毒素敏感细胞株的转染效率，还与DNA竞争转染试剂而影响转染试剂，还可以在免疫细胞中导致非特异性的免疫激活。起始样本量低，得率高，操作时间短，还能确保得到长片段的DNA且超螺旋占比高。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，质粒提取是分子生物学最常见的实验之一，目前质粒提取实验大多借助试剂盒来完成。

最近一些小伙伴，在后台留言说有丝分裂很难理解，想让我推送一期关于有丝分裂的，其实关于必修一的很多内容早在15年的时候，就退送过了，可能后面加入的小伙伴，没有看到，那时关注的人也少，于是今天决定把以前和大家分享过的有丝分裂，再和大家重温一下，期望对你这部分的学习有所帮助。生物都要经历出生、生长、成熟、繁殖、衰老直至死亡的生命历程，在你成长的岁月里，你是否有这样的疑问：但通常爸爸妈妈会这样告诉你：但后来逐渐长的大一点，我怀疑妈妈在骗我，但我也不明白我倒是怎么长大的

首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为：出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等细胞坏死（necrosis）则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。具体表现为：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应一、流式检测细胞凋亡的原理AnnexinV和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine,PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：AnnexinⅤ（膜联蛋白V）是一种分子量为35-36kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，将AnnexinV进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium,PI）是一种可与DNA结合的染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此，将AnnexinV与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。二、实验操作步骤收集细胞：取适量的对数生长期细胞接种于6孔板中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞（注：悬浮细胞直接离心即可）；清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；

常规的基因克隆一般分为以下二种1.通过限制性酶切的方法，直接从一个质粒上酶切获得目的基因片段，然后将其连接至目的载体上（目的载体亦经相应的酶切处理），获得相应的重组质粒。2.以基因组、cDNA或者质粒为模板，PCR扩增获得目的基因片段，并通过PCR引物带入合适的限制性酶切位点，然后酶切目的基因片段的PCR产物，再将其连接至目的载体上（目的载体亦经相应的酶切处理），获得相应的重组质粒。※服务内容根据客户要求，将目的基因片段构建至目的载体上，获得相应的重组质粒。※服务特点1.准确、快速、保证无突变。2.可实现超长片段的克隆。3.科文生物拥有多达5万多个不同种属基因的基因库以及1000多个载体的载体库，可以为客户提供各种现成的基因模板质粒以及目的载体，价格非常优惠，常规载体更可免费提供用于克隆构建。客户可以从科文生物购买所需的基因模板质粒及目的载体，然后再委托科文生物进行基因克隆构建，获得相应的重组质粒，体验一站式服务，省时省心省力。