酵母双杂交文库

实验原理：酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录激活结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。实验目的：酵母双杂交文库的构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。实验步骤1.1.RNA提取1.2.mRNA分离1.3.cDNA合成1.4.cDNA长度分级1.5.分级后的cDNA与酵母双杂交载体(pGADT7-Rec)进行infusion重组1.6.重组后产物转化感受态细胞1.7.文库铺板检测与菌液保存技术指标1.插入片段＞500bp（插入片段不是越长越好，较长的片段可能会漏筛部分较小片段的互作基因），2.重组率＞90%，3.库容≥1x108transformants，4.滴度≥2x107cfu/ml。交付结果1.文库构建报告（电子版），2.文库构建图片（电子版），3.转化到酵母细胞的双杂交文库甘油菌。服务周期25个工作日材料条件客户提供组织或细胞

查看酵母双杂交文库全部详情 >>