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载体构建

在获得想要的DNA片段之后,使用合适的载体可以对这些片段进行操作,实现想做的研究。目前,本公司有很多载体供大家进行各类实验,一般情况下,大家只需要选择并找到合适的载体就可以了。少数情况下,可能会涉及到需要对载体进行改造。方法通过酶切将DNA片段连入载体实验原理DNA连接酶可以催化相邻DNA链的5‘磷酸基团与3‘羟基形成磷酸二酯键,从而完成连接。常见的依赖限制性内切酶的连接,是将载体和目标DNA片段(外源片段)进行相同方式的酶,产生可以互补配对的粘性末端,然后进行连接。根据使用的酶数量,可以分成双酶切、单酶切两种类型。单酶切(或者产生两个平末端的双酶切)由于载体产生的粘性末端可以发生自连,需要使用去磷酸化酶处理载体,消除其5‘磷酸基团防止自身连接。而双酶切一般不会产生可以自连的粘性末端,不需考虑这一问题。服务周期10个工作日

染色体步移

染色体步移(Chromosomewalking)是用以鉴定已经克隆的特定DNA片段侧翼顺序的方法。从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆,该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆,如此重复,得到一个相邻的片段,等于在染色体上移了一步,故称之为染色体步移(ChromosomeWalking)染色体步移技术(genomewalking)是一种重要的分子生物学研究技术,使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。通常情况下,其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应,通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时,还可以根据第一次步移获取的序列信息,继续进行侧翼序列获取。

EMSA_emsa

实验原理:蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合,电泳时这种复物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢,出现相对滞后的条带。实验目的:体外分析DNA与特异性蛋白质之间的相互作用。操作步骤:1,制分离胶2,标记探针3,蛋白与探针混合孵育4,点样5,显影

双分子荧光互补

实验原理:在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase等)的两个β片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性,将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段,再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近,就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近,重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。实验目的:在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。交付结果:实验流程和共聚焦图片等结题报告(电子版)服务周期30个工作日材料条件客户提供构建好的BiFC质粒

DNA甲基化检测_dna甲基化检测

简要原理:以重亚硫酸盐处理基因组DNA,发生甲基化的胞嘧啶不变,而未甲基化的胞嘧啶会变成尿嘧啶,经过PCR扩增,原本的C/G就变成T/A,可以通过测序区分。该方法检测精确,分辨率最高,但耗时耗力,通量有限。实验目的:一般以下情况可以用此方法:精细定量检测目标区段的DNA甲基化情况;结合高通量测序检测全基因组DNA甲基化情况。试剂:重亚硫酸盐处理试剂盒操作步骤:1.高质量DNA样品抽提;2.DNA样品处理:目前基本都是使用商业化的试剂盒,处理方法参照试剂盒说明书;3.引物设计:针对检测的目标区域设计PCR引物4.PCR扩增和产物克隆:以重亚硫酸盐处理后的DNA为模板扩增,回收PCR产物后克隆的T载体上,挑取20个以上的阳性克隆进行测序;5.结果分析:结果分析网站。

亚细胞定位

一、实验原理:将目标蛋白基因与荧光蛋白的N端或C端融合,通过瞬时转染技术,使得该融合蛋白在受体细胞内表达,目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器中,通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置,确定目标蛋白的位置,从而确定目标蛋白的亚细胞定位情况。二、实验步骤:1、去内毒素质粒提取2、亚细胞定位实验(一)材料准备:(二)拟南芥原生质体的制备:(三)PEG转化(室温操作):三、实验结果:激光共聚焦拍照。

双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因实验(luciferaseAssay)目前由两个主要的应用方向,第一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用,转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合,这些特异性的序列被称为顺式因子,转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验(luciferaseAssay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段,第二是研究微小RNA(microRNA)对于靶基因的调控,通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列,并设计合适的microRNA质粒或干预片段,同时构建靶基因的报告基因质粒,二者同时转染细胞,这是确定microRNA是否能影响(上调或下调)靶基因的首选研究方法。实验原理:1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒,如pGL3-basic(转录因子与靶基因)或pMIR-REPORTLuciferase质粒(微小RNA与靶基因)2)将要检测的转录因子表达质粒(或microRNA质粒)与报告基因质粒共转染293细胞或目的细胞。如果此转录因子(或microRNA)能够激活靶启动子,则荧光素酶基因就会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。3)加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反应,产生荧光素,通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性,从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。实验步骤:(1)用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中。(3)筛选阳性克隆,测序,扩增克隆并提纯质粒备用。(4)扩增转录因子质粒(或microRNA质粒),提纯备用,同时准备相应的空载质粒对照。(5)培养293细胞(或其它目的细胞),并接种于6孔板中,生长24小时(80%汇合度)。(6)将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。(7)用适当的方法提取蛋白并用于荧光素酶检测。(8)加入酶作用底物,于荧光计数仪上测定荧光素酶的活性。(9)计算相对荧光强度,并与空载对照比较,判断影响因子是否有效的作用于靶基因。

染色质免疫共沉淀

实验原理及目的染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用最为主要的方法之一。本实验的原理是在活细胞状态下通过化学交联剂将蛋白质-DNA复合物固定,并将其随机打断成一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学的方法沉淀出目的蛋白质-DNA复合体,从而特异性地富集与目的蛋白相结合的DNA片段。通过对目的DNA片断的纯化与检测,最终获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫共沉淀技术广泛的应用于表观遗传(组蛋白等)分析,转录因子结合位点分析等蛋白质与DNA结合的试验分析中。随着第二代测序技术的逐步完善和成熟,染色质免疫共沉淀结合第二代高通量测序技术(ChIP-seq)正逐步成为基因调控网络研究中一种非常有效的研究手段。实验步骤A]实验材料的交联处理(室温):B]实验材料的染色质抽提(4度):C]染色质的超声波片段化(4度):D]染色质前处理和免疫共沉淀(4度):孵育抗体和磁珠染色质的预处理免疫沉淀E]洗脱蛋白质-DNA复合物并释放DNA(4度):F]纯化DNA(室温):G]对ChIPDNA进行定量:结果分析:%Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%;FoldEnrichment=[%(ChIP/Input)]/[%(Negativecontrol/Input)]服务周期20个工作日材料条件实验材料:ChIP级抗体,5ug/样本;细胞:大于107;动物组织:大于0.1g/样本;植物组织:5g/样本。交付结果实验报告(实验仪器设备、试剂、实验方法、数据分析结果);

酵母双杂交文库

实验原理:酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录激活结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的,并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体,分别与基因的ORFs融合,转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时,就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起,从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合,激活相应报告基因的表达,在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。实验目的:酵母双杂交文库的构建是筛库的前提,可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用,是现在分子生物学与生物化学常用的手段。实验步骤1.1.RNA提取1.2.mRNA分离1.3.cDNA合成1.4.cDNA长度分级1.5.分级后的cDNA与酵母双杂交载体(pGADT7-Rec)进行infusion重组1.6.重组后产物转化感受态细胞1.7.文库铺板检测与菌液保存技术指标1.插入片段>500bp(插入片段不是越长越好,较长的片段可能会漏筛部分较小片段的互作基因),2.重组率>90%,3.库容≥1x108transformants,4.滴度≥2x107cfu/ml。交付结果1.文库构建报告(电子版),2.文库构建图片(电子版),3.转化到酵母细胞的双杂交文库甘油菌。服务周期25个工作日材料条件客户提供组织或细胞

酵母单杂交文库

真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—bindingdomain,BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子,GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS),而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中,DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体,顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体,分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时,就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起,从而与上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合,激活相应报告基因的表达,在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果,这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性,这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。我公司总经理毕业于华中农业大学生化与分子生物学专业,博士期间长期从事酵母单/双杂交文库构建及筛选(Clontech体系,针对胞浆蛋白和核蛋白)的工作,在校期间为实验室构建了3个高效的水稻酵母双杂交文库(组织分别为水稻叶片,幼穗,种子),具有丰富的实践经验。本公司在RNA抽提,mRNA纯化,酵母转化等步骤中对于试剂选择有着独到的见解,用性价比最高的试剂为客户节约成本。同时公司对于反转录,酵母转化,酵母菌落PCR等步骤进行优化,使得初始基因丰度更高,最大程度保证互作基因/蛋白不致遗漏;转化效率更高,提高弱互作因子筛到的可能性;均一化更高,降低重复筛到概率;空载体更少,高效并且节约成本。通过RNA提取,mRNA分离,cDNA合成,cDNA长度分级,分级后的cDNA与酵母单杂交载体(pGADT7-Rec2)进行infusion重组,重组后产物转化感受态细胞,文库铺板检测与菌液保存获得插入片段>500bp(插入片段不是越长越好,较长的片段可能会漏筛部分较小片段的互作基因),重组率>90%,库容≥1x108transformants,滴度≥2x107cfu/ml的酵母单杂交文库。客户提供新鲜组织或细胞,25个工作日交付酵母单杂交文库构建报告(电子版),酵母单杂交文库构建图片(电子版),转化到酵母细胞的单杂交文库甘油菌100ml。可用于酵母单杂交,酵母双杂交,酵母三杂交文库的筛选。

 
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