样本要求及推荐使用的试剂盒
1.体外培养的细胞:离心处理采集的细胞悬液,吸弃上清液,立即提取DNA或在–20℃或–80℃下保存细胞。首选使用商业化提取试剂盒,如天根新鲜标本提取试剂盒(货号DP304)或Qiagen试剂盒。
2.新鲜组织样品:新鲜采集的组织可以立即冰冻,并在–80℃下,或者液氮中储存。首选使用商业化提取试剂盒,如天根新鲜标本提取试剂盒(货号DP304),或Qiagen试剂盒。
3.血液DNA提取:采用肝素或EDTA处理的血液样本可在2–8℃下储存数天,或在–20℃或–80℃下储存数周。此外,采用ACD溶液B(0.48%柠檬酸,1.32%柠檬酸钠,1.47%葡萄糖;每6ml血液使用1ml)处理的血液样本,在2–8℃下至少可储存5天,在–20℃下至少可储存1个月。如需长期储存,可准备血液细胞核,并在–20℃下储存。首选使用商业化提取试剂盒,如天根血液标本提取试剂盒(货号DP304)。
4.血浆或血清游离DNA:样本可在2–8°C下储存数小时。如需长期储存,建议在–20℃或–80℃下冰冻。首选使用商业化提取试剂盒,如天根血清/血浆游离DNA提取试剂盒(货号DP339)或Qiagen公司试剂盒。
5.干血斑基因组提取:建议使用商业化提取试剂盒,查dna提取纯化,dna提取试剂盒相关,如天根新鲜标本提取试剂盒(货号DP334)
6.石蜡包埋及病理组织切片:拿到样品后要尽快在4-10%的福尔马林中固定,固定时间以8-24小时为宜,时间过长导致基因组断裂,影响下游实验。选取保存时间不超过两年的样本,首选使用商业化提取试剂。如天根石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(货号DP330)或QiagenFFPEDNAkit(货号56404)。
7.质粒DNA:首选使用商业化提取试剂盒,一般小提试剂盒建议使用天根碱裂变质粒小提试剂盒(货号DP105),细胞转染用途等等要求较高的质粒提取建议使用Qiagen无内毒素质粒提取试剂盒。
样本DNA提取
1.体外培养细胞DNA的提取
2.新鲜组织样品DNA提取
①取新鲜或冻存的组织10-30mg(脾组织应少于10mg),加入500-1000ul冰的PBS,使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎(尽量越碎越好,形成细胞悬液),10000rpm离心1min,弃上清。
②加入200ul缓冲液GA,震荡混匀,加入20ul蛋白酶K溶液,混匀。
③56℃孵育裂解1-3h,期间可适当摇晃颠倒样品,使样品混匀裂解充分,直到组织块完全消失。
④加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃消化10min,溶液应变清亮,短暂离心去除管壁水珠。
⑤加入200ul无水乙醇,充分震荡混匀15s。
⑥将上一步所得的溶液和沉淀都转入到一个含2ml收集管的吸附柱CB3中,12000rpm(13400g)离心30s,弃流出液。
⑦向吸附柱中加入500ul缓冲液GD(使用前请确认是否已加入无水乙醇),12000rpm离心30s,弃流出液。
⑧向吸附柱中加入600ul漂洗液PW(使用前请确认是否已加入无水乙醇),dna提取纯化,其他生物制品,12000rpm离心30s,弃流出液。
⑨重复上一步一次。
⑩12000rpm离心3min,dna提取纯化,正规其他生物制品,以去除收集柱中残余液体。
⑪将吸附柱放入一个洁净的1.5ml离心管,吸附柱开盖后放置5min,以去除残余乙醇。
⑫加入ddH2O50ml,室温静置5min。
⑬14000rpm离心1min,收集洗脱液。
⑭测DNA浓度及OD260与280比值,保存样品于-20℃。
3.血液DNA的提取
①取200ul全血置于1.5ml离心管中,不足200ul,加入缓冲液GA补足,如需处理更大体积的血液,如300-1000ul,按以下步骤操作:在样品中加入3倍体积的红细胞裂解液(货号RT122),颠倒混匀,室温放置5-10min,期间可再颠倒混匀几次,10000rpm离心1min或3000rpm离心5min,弃上清留白细胞沉淀,加入200ul缓冲液重悬细胞。
②加入20ul的蛋白酶K,混匀。
③加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃消化10min,溶液应变清亮,短暂离心去除管壁水珠。
④加入200ul无水乙醇,充分震荡混匀15s。
⑤将上一步所得的溶液和沉淀都转入到一个含2ml收集管的吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,弃流出液。
⑥向吸附柱中加入500ul缓冲液GD(使用前请确认是否已加入无水乙醇),12000rpm离心30s,弃流出液。
⑦向吸附柱中加入600ul漂洗液PW(使用前请确认是否已加入无水乙醇),12000rpm离心30s,弃流出液。
⑧重复上一步一次。
⑨12000rpm离心3min,以去除收集柱中残余液体。
⑩将吸附柱放入一个洁净的1.5ml离心管,吸附柱开盖后放置5min,以去除残余乙醇。
⑪加入ddH2O50ml,室温静置5min。
⑫12000rpm离心1min,收集洗脱液。
⑬测DNA浓度及OD260与280比值,保存样品于-20℃。
4.血浆或血清DNA的提取
①取100-200µl血清/血浆到2ml的离心管中,如不足100µl,加缓冲液GA到100µl终体积。
②加入20ul蛋白酶K溶液,涡旋混匀。
③加入200µl的缓冲液GB(可加入1µlCarrierRNA储存液,浓度为1µg/µl,CarrierRNA储存液的配制见第2页),轻轻颠倒混匀。
④56℃孵育10min,并不时摇动样品。简短离心
⑤加入200µl的乙醇(96-100%)。如果室温超过25℃,请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品,室温放置5min,简短离心以去除管盖内壁的液滴。
⑥将上一步所得溶液添加到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃废液,将吸附柱CR2放回收集管中。
⑦向吸附柱CR2中加入500µl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃废液,将吸附柱CR2放回收集管中。
⑧向吸附柱CR2中加入600µl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,弃废液,将吸附柱CR2放回收集管中。
⑨重复操作步骤8。
⑩12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2-5min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑪将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中,向吸附膜中间位置悬空滴加20-50µlddH2O,室温放置2-5min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。
⑫为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再次加入吸附柱CR2中,室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,收集洗脱液。
⑬测DNA浓度及OD260与280比值,保存样品于-20℃。
5.干血斑DNA提取
6.石蜡组织样品DNA的提取
7.质粒DNA提取
①溶液P1在使用前先加入RNaseA和TIANRed(将试剂盒中提供的RNaseA和TIANRed全部加入),混匀,置于2-8℃保存;使用前请先在漂洗液PWT中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。
②取1-4ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
③向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA和TIANRed),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。彻底颠倒混匀,混匀后的溶液为澄清的红色。将混匀后的溶液加入到收集好的菌体中彻底混匀,由于菌体的存在,混匀后的溶液为浑浊的红色。
④向离心管中加入150μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意温和地混合,不要剧烈震荡,以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠,如果未变得清亮,可能由于菌体过多,长沙科文生物科技有限公司,科文生物科技,裂解不彻底,应减少菌体量。由于使用了TIANRed,添加溶液P2彻底混匀后,溶液的颜色为澄清的紫色。如果在紫色中混杂有浑浊的红色,则说明裂解不充分,继续混匀直至溶液颜色完全变为澄清的紫色。
⑤向离心管中加入350μl溶液P5,立即快速地上下颠倒混匀12-20次,充分混匀,此时将出现絮状沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心2min。注意:加入溶液P5后应立即混合,应快速上下颠倒混匀,避免产生局部沉淀。上清中含有少量微小白色沉淀对后续实验没有任何影响。如果上清中存在大量微小白色沉淀,可再次离心后取上清。由于使用了TIANRed,添加溶液P5彻底混匀后,溶液为澄清的黄色,如果在黄色中混有紫色,则说明复性不充分,继续混匀至溶液颜色完全变为澄清的黄色。
⑥将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
⑦向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。
⑧将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心1min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
⑨将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液TB或ddH2O,12,000rpm(~13,400×g)离心30秒将质粒溶液收集到离心管中。
⑮测DNA浓度及OD260与280比值,保存样品于-20℃。